Reformatsiooni jutlustajad jõudsid Liivimaa linnadesse väga ruttu. Riia reformaator Andreas Knopken esitas oma reformatsiooniteesid juba 1522. aastal. Tallinnast on teateid uut tüüpi jutlustest 1524. aasta algusest. Jutlustajad nõudsid, et lähtutaks ainult piiblist, ja õpetasid, et ainult usk teeb õndsaks, mitte inimese teod. Miks Martin Lutheri õpetus nii kiiresti Liivimaal levis, on tagantjärele raske seletada. Igal juhul leidis see siin viljaka pinnase, sest ilmaliku ja vaimuliku võimu vahekorrad olid pingestatud juba varem.

Lutheri õpetuse levitajate kõrval tuli Liivimaale ka selliseid jutlustajaid, kes soovisid kirikut ja ühiskonda veelgi radikaalsemalt ümber kujundada. Riias, Tallinnas, Tartus ja mitmel pool mujal kihutasid nad rahvast üles rahutustele. Linnavalitsustel õnnestus kord siiski üsna ruttu taastada. Ulatuslikumat talurahvasõda, nagu see leidis aset mõnel pool Saksamaal, Liivimaal ei toimunud.

Linnade raed võtsid kirikuelu ümberkorraldamise kindlalt enda kätte. Esmalt pagendati ühed teravamad uue õpetuse vastased dominiiklased. Linnavalitsus moodustas kiriku sissetulekute haldamiseks fondi, nn jumala-laeka, kust hakati vaimulikele palka maksma ja mille kaudu korraldati vaeste hoolekannet. Jumalateenistusi hakati ladina keele asemel pidama saksa keeles. Varem oli igas linnakirikus peetud ka eestikeelseid jutlusi, nüüd seati eestlastele sisse eraldi kirik, Tallinnas sai selleks Püha Vaimu kirik. Reformatsiooni levikut pärssis esialgu Saksamaalt tulnud reformaatorite vähene kohalike keelte oskus, kuid selles tehti kiiresti edusamme. Tallinna jutlustaja Simon Wanradti koostatud katekismuse tõlkis Johann Koell eesti keelde ja see avaldati trükis 1535. aastal. Tegemist on esimese tänapäevani osaliselt säilinud eestikeelse raamatuga. Osa eestikeelseid tõlketekste levis ilmselt ka käsikirjadena.

Hoopis vaevalisem oli reformatsiooni levik maal. Selle peamine põhjus on Liivimaa maahärrade otsustusvõimetus. Osalt on see mõistetav, sest ka keisririigis käisid vaidlused uue usu staatuse üle edasi. Peale selle nappis maahärradel võimu: näiteks luterlasest Riia peapiiskop Wilhelm ei suutnud reformatsiooni oma stiftis läbi suruda. Sama probleem vaevas uue usu vaimus tegutsenud ordumeistreid. Reformatsioon muutus oluliseks teemaks maahärrade ja seisuste vahelises võimuvõitluses: kui üks osapool oli poolt, siis teine oli vastu ja ümberpöördult.

16. sajandil algas mitme Põhja- ja Ida-Euroopa riigi vahel võitlus ülemvõimu pärast Läänemerel, mis hakkas ohustama Liivimaa julgeolekut. Kõigepealt jäid venima 1551. aastal Moskva suurvürstiriigiga vaherahu üle peetavad läbirääkimised. Liivimaalastel õnnestus rahu lõpuks pikendada, kuid ainult koos lubadusega ära maksta venelaste nõutud „Tartu maks“. Moskva oli muutunud tugevaks jõuks, kes survestas kõiki oma naabreid. Samal ajal puhkes Liivimaal Saksa ordu ja Riia peapiiskopi vahel sõda. Peapiiskopile tuli appi Poola, kellega ordu oli sunnitud rahu tegema. Kuid liivimaalased ei pidanud kinni lubadusest tasuda „Tartu maksu“ ning 1558. aasta talvel saatis Moskva suurvürst Ivan IV Julm Liivimaale suure sõjaväe. Sellega algas pikk sõdade periood, mida on nimetatud koguni Liivimaa 100-aastaseks sõjaks.

Keskaegse Liivimaa pärast peetud võitlusi mõjutasid sisemised ja välimised tegurid. Võimalik, et Ivan Julmal ei olnudki esialgu plaanis kogu maad vallutada, vaid piirduda tavalise rüüsteretkega. Narva ja Tartu langesid ta kätte võrdlemisi lihtsalt ning valdustega koos tekkis Ivanil Liivimaal pooldajaid. Saksa ordus oli omakorda kujunenud välja huvigrupp, kes soovis tugevdada koostööd Poolaga. Osa liivimaalasi ootas kriitilises olukorras abi Taanilt. Taani kuningas ostis endale Saare-Lääne piiskopkonna, andes selle oma vennale valitseda ning pretendeeris isegi kunagistele Taani aladele Põhja-Eestis. Sõjast ei jäänud kõrvale ka Rootsi, kelle peale lootsid Tallinna linn ja Harju-Viru rüütelkond. Kuna maa vanad valitsejad ei suutnud rahvast kaitsta, puhkes Põhja-Eestis talurahva ülestõus, mis segadust veelgi suurendas.

1561. aasta suveks olid Tallinn ja Põhja-Eesti jõudnud läbirääkimistega niikaugele, et linn ja rüütelkond alistusid Rootsi kuningale. Veel samal sügisel leppis viimane ordumeister Gotthard Kettler Poola kuningaga kokku, et Liivimaa allutatakse Poolale. Liivimaa tuleviku jaoks tehti igasuguseid plaane, näiteks Taani kuninga vend hertsog Magnus üritas Ivan Julma abil Liivimaa kuningaks saada, kuid see katse ei kestnud kaua. Pikemas perspektiivis jäid Liivimaal rivaalitsema kaks osapoolt: Poola ja Rootsi.

Keskaegse Liivimaa lagunemise taga olid kindlasti tugevamate naaberriikide rünnakud. Mitte vähem tähtis polnud aga Liivimaa seisuste suutmatus kokku leppida ühtses poliitikas. Liivimaa kui terviku jaoks oli see kahtlemata nõrkus. Teisest küljest suutsid Liivimaa linnad ja rüütelkonnad oma keskaegseid privileege säilitada kuni 19. sajandini, mis näitab Liivimaa üksikute osade sisemist tugevust.